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200kd的大蛋白western blot的实验

A1:首先使用6-8%的分离胶,其次电转时间适当延长,250mA,90分钟左右。如果同时需要跑一些分子量小的蛋白,最好将大小两种膜分开转膜

A2:注意以下问题:1、 缓冲液中加甲醇的作用是使SDS游离出来,并增加膜结合蛋白的量,但过多的甲醇会使胶收缩,造成大分子在凝胶中的沉淀而降低转膜效率。大分子量的蛋白质(如大于60kDa)应使用低浓度的甲醇或不使用甲醇。

2、 电转移效果检查方法:①考马斯亮兰染色电转移后的凝胶,检查是否还有蛋白质存留;②丽春红染色,检查膜是否吸附了蛋白质。

3、 湿式电转方法效率高,半干式电转方法转移速度较快。

4、 阻断剂有BSA、Tween-20、脱脂奶粉和其他动物的血清等多种,阻断的效果不尽相同,如果实验中发现背景过高,可以尝试更换阻断剂。

5、 一抗和酶标二抗的浓度十分重要,浓度过高,造成背景过高;浓度过低造成灵敏度偏低,实验中应根据一抗和酶标二抗的效价,对此参数进行优化。此外,一抗的质量十分关键,抗体特异性和效价直接影响实验结果。

6、 须严格控制假阳性反应,可使用免疫前血清作为阴性对照,同时要以抗原作为绝对的阳性对照,准确确定阳性条带的位置。

A3:6%左右的胶,电泳的话得试一下,80V,先跑半小时,然后100V跑半小时,0.45mm 的PVDF膜,转膜普通转膜液350MA,90分钟左右

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