我们知道WB实验步骤繁琐，一次实验历时也不短，从提蛋白到显影结束可能要三天，我们就讲一下这里面的一些关键环节。

一、蛋白提取及变性

1、提取蛋白 很多经验丰富的WB实验者都深有体会，蛋白提取是影响结果最重要的环节之一。该过程最重要的是防降解和保证蛋白浓度不要太低。防降解主要有两点，一是裂解前注意保持样品处于低温环境中，二是裂解时加入足够的蛋白酶抑制剂。我们习惯先用冰冷的PBS做心脏的体循环灌注，然后冰上取脑，分离各脑区（嗅球，皮层，海马，中脑，小脑，延髓，丘脑，纹状体）后置于1.5EP管中，用液氮速冻后转移至-80度冰箱长期保存。接着是保证蛋白浓度，即要加入适量的裂解液，加太少会使蛋白提取不充分，加太多会让蛋白浓度太低，一般经验是这样的，细胞样品例如一个六孔板的细胞加60微升的裂解液，动物组织的话每毫克组织加10微升裂解液。最好还要加上超声破碎处理，具体方案见讨论部分。如果没有超声破碎仪，那就用1毫升注射器不断抽吸，冰上反复抽吸1分钟左右，注意不要产生过多气泡。（需要灌注取材的视频可以私聊获取，由于文件过大，又比较血腥，不宜直接放到文章里。）

2、蛋白变性 加入上样缓冲液后100摄氏度煮10分钟，这里的上样缓冲液有两种可选，一种是用beta巯基乙醇打开蛋白质分子二硫键的，另一种是用DTT（二硫苏糖醇）。两者的作用是一样的，但特点不一样，前者更容易与氧气反应，稳定性比后者差，如果在常温下暴露在空中，前者只能维持24小时的活性，后者却可以维持7天左右。所以该如何选择？如果是蛋白样品较少，跑几次就可以用完的样品，这时选择beta巯基乙醇。如果样品很多，计划跑上几十次的，优先选择DTT,建议变性后分装保存。

二、SDS-PAGE凝胶配制

1、配胶前准备 首先强调一下，一块好的胶是跑好蛋白的前提，所以这个环节也不容忽视。玻璃板的选择，一种是1毫米厚度的，另一种是1.5毫米的，这个厚度选择也是有讲究的，如果上样体积小于10微升，优先选1毫米，否则选1.5毫米的。原因是什么？答案在转膜部分揭晓。还有分离胶的浓度也要选择适合的。然后玻璃板和梳子要洗干净，晾干。装板，注意厚板和薄板的底部要对齐，否则会漏胶。加制胶的各成分前，要观察液体是否有沉淀，有沉淀的尽量不要用。

2、制胶 按配方说明依次加入各组分，加完SDS后先简单手动摇匀几下，然后迅速加入过硫酸铵和TEMED,摇匀，紧接着就灌胶。然后我习惯用95%的酒精压胶，我也用过纯水，感觉纯水压没那么好，由于水的密度较大，会把分界处的胶压得膨大。静置25分钟后把酒精倒干，用吸水纸吸出多余的酒精，然后配压缩胶，同样的操作，关键是梳子要插得快，要小心梳子下产生气泡，然后静置30分钟。如果是当天跑胶，我会等上层胶凝2个小时再用，但要注意防干燥缩水，可以在一个小时的时候沿着梳子上缘加点电泳液。所以我一般提前一晚制胶，泡于纯水或者电泳液里置于4度冰箱暂存。

三、蛋白电泳

1、上样前准备 把胶组装到电泳芯上，注意密闭性（否则漏液），如果内槽漏液就不是匀强电场了，最后条带可能就不是一条直线。然后内槽倒满电泳液，拔梳子，这一步要小心，梳子要两边一起缓缓往上拔出，然后观察泳道内有无脱落的胶粒或者胶丝，有的话用1毫升注射器吸出。然后从冰箱取出蛋白样品，解冻。准备振荡器。

2、上样和电泳 注意，上样后蛋白会开始慢慢在胶中弥散，所以上样越快越好。我习惯先上蛋白Marker,再上蛋白样品，蛋白上样前确保样品完全解冻和充分振荡（推荐使用振荡器振荡），吸的时候没有拉丝即可，建议上样前五分钟把样品从冰上取出来，不然样品中SDS可能会结晶析出，从而影响电泳效果。上层胶80V 25分钟，下层胶120V 65分钟。

四、转膜

1、转膜前准备 我会在电泳结束前30分钟准备，把转膜液配好置于4度冰箱预冷，然后裁膜，准备转膜装置，准备碎冰和冰砖。最后把膜置于甲醇溶液中活化1分钟，然后转移至转膜液中平衡3分钟后备用。

2、转膜 组装转膜三明治夹，这一步很关键，最重要的是胶和膜之间不能有气泡且膜与胶要保证贴合紧密（否则会翻车），可以加多点转膜液泡着。组装好后加满转膜液，设置电源参数，我习惯恒流转膜，200-280毫安，1-2小时，根据分子量定，如50KD的分子用60分钟就够了。如果一个电源带两个转膜大槽即四块胶，我就会用恒压70-110V。这个过程最重要的是做好降温。这里简单说一下蛋白分子量与玻璃板厚度，分离胶的浓度，转膜电源参数的选择问题。如果是能用1毫米的玻璃板就不用1.5毫米的，因为转膜是在电场的作用下蛋白分子从胶上迁移到膜上，1毫米胶的蛋白迁移距离要比1.5毫米的短1/3。选择更薄的胶蛋白转膜时间可以减少，从而减少发热，以免胶变形，条带也会更好看。然后是分离胶的浓度，如果是150—200KD的分子选10% 以下的的分离胶，200—300KD的选8%的,300KD以上的选6%的，小于30KD的200mA 30分钟，30-100KD的按分子量的数值算，如70KD，250mA 70分钟；100-150KD的250mA 100分钟；150—300KD的分子转膜条件用280毫安(以上均是对于1.0mm的玻璃板来说的，1.5mm的要适当延长时间)，120分钟足矣，前提是胶的浓度相适应。

五、封闭孵一抗

1、封闭 转膜结束后，把膜先用TBST泡洗两遍再用5%脱脂奶粉或者BSA室温封闭1-2小时。注意一定要让蛋白面充分接触封闭液。

2、孵一抗 脱脂奶粉封闭的话，要用TBST泡洗三遍再转移至一抗溶液中，BSA封闭的可以直接转移至一抗中。如果膜的宽（膜是一个长方形，这里的宽与长相对应）不大于8毫米，我习惯置于15毫升离心管中孵育，两条膜"背对背"式放置于一个管子里（3毫升液体即可）。如果大于8毫米，就用普通的5格的一抗孵育盒（4毫升即可）。4度过夜，一般是12-18个小时，注意放置水平，最好用摇床。内参等蛋白丰度很高的如果孵久了可能出现条带连在一起的情况，这时可以缩短孵育时间或者降低一抗的浓度。

六、孵二抗显影

1、孵二抗 室温一个小时足矣。这步要注意的是建议用5%BSA或者脱脂奶粉稀释二抗，这样背景会干净许多。也要注意膜的蛋白面要充分接触二抗溶液，我们一般一条膜一个槽地孵。

2、显影 这一步有个细节可能有些同学没注意到，就是ECL发光液要与HRP反应一分钟后显影效果才会更好，还有要注意的是显影液要均匀覆盖，一般第二次显影（加新的显影液）比一次好看。