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干货分享 | PCR反应污染原因追踪及污染处理方法

PCR反应的特点 是具有较大扩增能力与灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。


1、污染原因


1、标本间交叉污染: 标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。


2、PCR试剂的污染: 主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。


3、PCR扩增产物污染. 这是PCR反应中最主要的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性。


还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。


4、实验室中克隆质粒的污染: 在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大。


污染的监测:一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染。

2、污染处理


1.环境污染


(1)稀酸处理法: 对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA脱嘌呤。


(2)紫外照射(UV)法: 紫外波长(nm)一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是,选择UV作为消除残留PCR产物污染时,要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV照射仅对500bp以上长片段有效,对短片段效果不大。UV照射时,PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体,这些二聚体可使延伸终止,但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体,且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长,嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。


在受照射的长DNA链上,形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基,其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型嘧啶复合体,胸腺嘧啶乙二醇,DNA链间与链内的交联和DNA断裂等)均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点(0.13/碱基)在DNA分子上随机分布,一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点,那么,105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反,如果100bp的片段,每条链上仅有6处损伤,105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。


2.反应液污染


可采用下列方法之一处理:


(1)DNase I法: PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活,然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列。


(2)内切酶法: 选择识别4个碱基的内切酶(如Msp I和Taq I等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h 后加热灭活进行PCR。


(3)紫外照射法: 未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述UV照射法。


(4)g射线辐射法: 1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子,4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。


3.尿嘧啶糖苷酶(UNG)法


由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右,因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。


(1)原理: 在PCR产物或引物中用dU 代替dT.这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育,因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键,可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶,而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。


(2)dUTP法: 用dUTP代替dTTP,使产物中掺入大量dU.在再次进行PCR扩增前,用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含dU的新的PCR产物。


(3)dU引物法: 合成引物时以dU 代dT,这样PCR产物中仅5ˊ端带dU.UNG处理后,引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段(1-2kb以上)的扩增用dUTP法效率较用dTTP低,而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。


(4)优点: 可以去除任何来源的污染;UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行;由于扩增产物中有大量dU存在,可彻底消除污染源。


(5) 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响,在进行PCR产物克隆时,应该转化UNG-(UNG缺陷)大肠杆菌受体菌,否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。


4. 固相捕获法


用于去除标本中污染的核酸和杂质,原理如下:


(1) 用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交,杂交区域是非扩增区。


(2) 用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸,通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质。


(3) 洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第(2)步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。


5.RS-PCR法(RNA特异性PCR)


也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法,该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物,逆转录引物的3ˊ端(A区)有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列,5ˊ端2 0个核苷酸(C区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后,经超速离心使 cDNA与多余引物分开,再用和第二引物(C)以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA,而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。


6.抗污染引物法


该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中,在重组质粒中,这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本,也不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。


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