1 免疫印迹（western blot）灰度值（gray scale）计算实操

1.1 image J 分析灰度值

1.1.1 打开 image J；

（图1 image J打开界面）

1.1.2 打开需要分析的图片：“file- open- 找到图片”；

（图2打开需要分析图片界面展示，此处展示的内参β-ACTIN）

（图3 western blot 图片转换为灰度图设置）

1.1.4 将图片背景灰度统一：“process- Subtract Background”，然后将“rolling ball radius，参数设置为50”，复选框选中light background；此处的设置能够消除背景的影响；

（图4 图片背景灰度统一设置）

（图5 图片背景灰度统一设置参数调整）

（图6 完成灰度背景统一设置后图片展示，可见背景颜色一致）

1.1.5 翻转图片的黑白：“edit- invert”；

（图7 图片黑白翻转设置）

（图8 图片黑白翻转后展示）

1.1.6 分析测量设置：“Analyze>Set Measurements，选择Area面积、平均灰度值Mean gray value、极大小灰度值 min& max gray value、积分灰度值Integrated dendity”；

（图9 测量参数设置命令操作）

（图10 参量参数复选框设置）

1.1.7 将测量的单位设置为像素 pixels：“analyze- set scale”；

（图11 测量单位定义为像素 pixels设置）

（图12 设置为像素的相关设置，并定义到全部Global）

2.1 条带的选择和对应光密度的测量：图15红色箭头指向，分别表示举行，椭圆、和不规则图形，我一般比较喜欢用矩形选框；

（图13 选择条带的框）

2.2 测量印记的灰度值，使用矩形/椭圆/不规则选框选择需要测量的印记，然后使用快捷键（ctrl + M）或者菜单命令“analyze- measure”，尽量使用同一个框去测量所有灰度条带（不是必须）；

（图14 选中需要测量的印记条带）

2.3 获得对应条带数据；

（图15 测量结果展示，红框标记部分IntDen即为本次测量的光密度数值）

2.4 条带数据的保存；

（图16 数据导出设置）

（图17 导出数据命名设置）

采用同样的办法，将目标蛋白的灰度值计算出来！

3 GraphPad软件统计分析与作图

3.1 首先使用excel对蛋白相对表达进行预处理，其中target protein 和 β-Actin的数据是通过image J测量获得的灰度值值，而relative expression数值来自于target protein灰度值/β-Actin灰度值；

（图18  Excle预处理数据示意图）

3.2 打开GraphPad，选择“column”，然后点击create即可；

（图19 创建GraphPad 柱状图column操作）

3.3 对新建的表格进行命名，左侧红框表示分析时间+分析内容；右侧红框上边是阴性组NC和处理组Treat，下边对应的数值是本次检测蛋白相对表达的灰度值（GraphPad 转置粘贴快捷键“ctrl + shift+ T”）；

（图20 新建数据表格命名以及数据张贴）

3.4 数据分析“analyze”;

（图21 数据统计选框）

3.5 统计方法的选择，在此，因只有两组数据，我们选择 t test，然后点击OK，即可；

（图22 选择 t test操作）

3.6 使用参数非配对t test，如图中红框所示；

（图23 使用参数非配对t test）

3.7 统计结果解释说明，P value表示统计差异（＜0.05即表示有统计学差异），P value summary这里的几个星标可以用于后期作图，一般用1-3颗星即可，significantly different是对P value的进一步说明；

（图24 统计结果展示）

3.8 作图，点击左侧Graphs对应的统计表格名称即可，后侧是提供的图片展示类型，一般差异较小的使用mean/median & error；误差线 error bar 可选择SD或者SEM

（图25 数据作图以及图片展示类型选择）

（图26 图片根据默认获得的图片展示）

3.9 图片美化

3.9.1 首先将主要title和X title删除，并对X-Y周进行命名；

（图27 删除多余title和X-Y轴命名后图片展示）