小鼠海马神经元细胞的分离培养及鉴定

【简介】

长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成,细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中,细胞体是细胞含核的部分，其形状大小有很大差别，直径约4～120微米,核大而圆，位于细胞中央，染色质少，核仁明显,细胞质内有斑块状的核外染色质（旧称尼尔小体），还有许多神经元纤维,细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突,每个神经元可以有一或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体,每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。

【材料】

1d出生小鼠、手术剪、手术镊、75%酒精、双抗PBS、FBS、培养皿、15ml离心管、胰蛋白酶、DMEM/F12、神经细胞专用培养液；

【方法】

1包被:培养前一天将培养板或培养瓶或皿用0.01%多聚赖氨酸包被过夜,第二天早上来吸除包被液在无菌超净台中自然晾干后放置于培养箱中备用;

2配制神经元专用培养基(DMEM/F12培养基中添加1%谷氨酰胺,2% B27,1%双抗)

3取脑:选取新生24h之内的小鼠，数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下分层剪开头皮,颅骨,用弯镊拉开脑区视野,小心取出全脑,用预冷的PBS洗数次;

4分离:以脑中线为起点,小心拨开大脑颞叶皮层,暴露出新月状海马回,小心夹出海马组织,置于预冷的PBS中,仔细剔除微血管,用眼科剪充分剪碎组织。

5消化:加入同体积0.125%的胰蛋白酶,放入培养箱中消化30分钟,期间每隔5分钟轻摇一下;

6过滤:加入数滴胎牛血清终止消化,用吸管轻轻吹打细胞数分钟,至液体成米糊状即停止吹打,动作务必轻柔,用200目细胞筛过滤收集细胞悬液。

7接种:300rpm离心5分钟,去除上清,用DMEM/F12完全培养基重悬细胞,轻轻吹打,调整细胞浓度接种;

8换液:6小时后将DMEM/F12完全培养液全量换成神经元专用培养液,第48小时后加入一定浓度的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞过度生长,随后每3天半量换液;

【培养】

神经细胞专用培养液:DMEM/F12培养基中添加1%谷氨酰胺,2% B27,1%双抗;

【鉴定】

1.形态学的观察:可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常明显;
2.免疫学鉴定：NF（神经丝）或者tubulin阳性表达;