小鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPCs）的分离培养及鉴定

【简介】

EPCs是一群具有游走特性，能自我更新、增殖分化为内皮细胞的多能干细胞，具有迟发性高增殖潜能及定向归巢特性。它与血管新生、心血管组织工程内皮化等关系密切，在基础研究、肢体缺血性疾病及心血管疾病等领域有关EPC的研究非常活跃，从而为治疗缺血性疾病、血管组织工程及肿瘤治疗提供了新的思路和手段；

【材料】

3-8周龄小鼠、手术剪、手术镊、75%酒精、双抗PBS、Percoll淋巴细胞分离液、M199、FBS、培养皿、15ml离心管、10μg/ ml人纤连蛋白包被盖玻片；

【方法】

1）脱颈处死，75%酒精浸泡5min，将股骨、胫骨迅速从小鼠中剥离下来，置于平皿中PBS浸泡，去除表面肌肉，PBS清洗干净；

2）骨头移入新皿剪开两端，培液冲洗骨腔，吹打混匀，1000R/5min，弃上清，培液重悬；

3）悬液缓慢加入预先装有等量体积Percoll（1.083g/ml）离心管中2500R/30min（也有2300R/20min，2000R/20min）；

4）收集离心后中间云雾状白膜层单个核细胞，培液洗涤两次，1000R/5-8min，弃上清；

5）含10%FBS的专用培养液重悬，37°培养，24h后将含有未贴壁细胞的上清液转入新皿培养，2-3d首换液，之后每3d换液一次（注：24h取上清重新贴壁培养和不取上清一直培养后的细胞做鉴定都是EPC细胞）；

【培养】

内皮专用培养液：10%FBS、M199（50ug/ml ECGS）、b-FGF（20ng/ ml）、VEGF（10-20ng/ml）、肝素钠（10ug/ml）；

【鉴定】

1）免疫荧光阳性：

造血干/祖细胞标志（CD133、CD34）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）、血管性血友病因子（vWF）；