RNA 提取试剂(Trizol)

RNA 提取试剂(Trizol

发布日期:2019-09-10 浏览次数:617

产品组分
 

产品编号

产品名称

产品规格

储存条件

M00501-100

Trizol
(
RNA 提取试剂)

100ml

2-8°C 避光保存 12 个月

M00501-250

250ml

M00501-500

500ml

 
产品简介
       该产品是一种即用型,适用于细胞或组织总 RNA 提取的含有指示剂的试剂。该产品的作用原理采用与 Invitrogen 公司的 TRIzol 相似的原理和方法,主要成分为苯酚和异硫氰酸胍等,提取步骤和方法也相同。指示剂的颜色也与 TRIzol 的颜色一致,加入氯仿后离心分层,形成上清层、中间层和有机层,上层水相(含 RNA)呈无色,下层有机相呈紫红色。RNA 经异丙醇沉淀便可得到总 RNA。该产品具有极强的裂解能力,可以短时间内裂解细胞和组织样本,并有效**样本中 RNA 的降解,保持RNA 的完整性。提取的RNA 可直接用于多种分子生物学实验,比如RT-PCR Northern blot,体外翻译、cDNA 克隆、RNase 保护实验以及高通量测序等对 RNA 质量要求较高的情况。

使用注意事项

1、本产品中含有苯酚,具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会引起中毒、灼伤及其他身体伤害。使用时应穿戴防护服装、手套、面罩等防护物。如果不小心接触到眼睛时,应立即用大量水冲洗然后前往医院进行**。
2
、请穿实验服并佩戴一次性手套进行实验操作,避免 RNase 污染。
3
、使用 RNase-free 的塑料制品和*头避免交叉污染;所有离心管及相关溶液都必须无 RNA 酶污染。
4
、请自备氯仿、异丙醇(新开封或提取 RNA **)、75%乙醇(DEPC 处理水配制)、DEPC DEPC 处理水。
5
、使用冻存的细胞或组织抽提总 RNA 的效果通常会比新鲜的细胞或组织差一些,因为冻存过程中细胞或组织内的 RNase 会被释放出来并剪切样品。推荐:如果不能及时抽提 RNA,先加入适量 Trizol 试剂,裂解样品然后再冻存,这样 RNase 就不会降解样品。

6、样品匀浆后,加入氯仿前,可在-80°C 冻存放置一个月。
7
RNA 沉淀可以保存在 75%乙醇中,2-8°C 放置一周或-20°C 放置一年。
8
、该试剂盒**于专业人员的科学研究使用,不得用于临床诊断或**,更不得用于食品或药品中。

实验步骤

1、细胞裂解或组织匀浆:
          a. 
贴壁细胞:吸尽培液,按照比例加入 Trizol 消化细胞,即每 10 平方厘米细胞中加入 1 ml Trizol,六孔板每孔加 1 ml Trizol12 孔板每孔加 0.5 ml Trizol。晃动 3-5 下,再用移液器反复吹打几下,确保细胞全部裂解,然后将溶液转移至离心管中。【注】加入 Trizol 量不足时,会导致 DNA 污染。
          b. 
悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,每5×106-1×107 个细胞加入1ml Trizol, 再用移液器反复吹打。【注】加入 Trizol 前应避免洗涤细胞,会增加 mRNA 降解的可能性。
          c. 
动、植物组织:取-80°冻存的组织在液氮中充分研磨后加入适量的Trizol混匀;或者取新鲜动物或植物组织尽量剪碎,然后加入适量的 Trizol 进行匀浆处理。
2
、将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置 5 分钟以使**白体完全裂解。【注】此步不能省略,时间可以长于 5 分钟。
3
、(可选步骤)4°C12000rpm 离心 10 分钟,取上清。【注】如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等可离心除去。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量的 DNA 等物质,上清中含有 RNA。处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂, 应除去,然后再取澄清的匀浆溶液进行下一步的操作。
4
、每毫升 Trizol 加入 0.2ml 氯仿,Vortex 混匀或猛烈晃动 15 秒,室温放置 3分钟。
5
4°C12000rpm 离心 15 分钟,样品会分成三层:上层无色的水相、中间蛋白层和紫红色的下层有机相。然后吸取含总 RNA 的上层无色水相至一新的RNase-free 的离心管中。

6、按照每毫升*初的 Trizol 加入 0.5 ml  异丙醇的比例,颠倒数次混匀,室温沉淀 10 分钟,或者-20°C 沉淀 30 分钟,或-70°C 沉淀过夜。【注】如果希望提取microRNA 等小 RNA 时,推荐使用低温长时间的沉淀,来获得**效果。
7
4°C12000rpm 离心 10 分钟,在管底可见 RNA 沉淀,弃上清。【注】纯度越好的 RNA 沉淀会在管侧和管底形成透明胶质状,不容易看清楚。
8
、按照每毫升*初的 Trizol 加入 1 ml 75%乙醇(DEPC 水配制)的比例,Vortex混匀或颠倒混匀,让沉淀悬浮起来以充分洗涤沉淀中的盐分。
9
4°C12000rpm 离心 5 分钟,弃上清。剩余的少量液体再用离心机瞬甩一下, 彻底去掉上清液。注意不要吸到沉淀,否则会造成 RNA 损失。
10
、室温放置空气干燥 5-10 分钟,待 RNA 沉淀略干后,加入适量(约 20-100µl)的 RNase-free 水溶解 RNA 沉淀,-80°C 冻存。【注】切勿让 RNA 彻底干燥,否则将导致 RNA 溶解度降低。

产物检测

1RNA 完整性检测
        取 1 µl RNA 加入适当 RNA loading buffer,混匀,进行电泳检测。若出现清晰的三条带,分别为 28S18S 5S,且条带之间界限清晰,就证明 RNA 样品的完整性非常好。可参考以下图示:


2RNA 纯度检测


     利用分光光度计或者NanoDrop 仪检测RNA 样品在260nm280nm 处的OD 值, 并计算 A260/A280 的比值。纯的 RNA 的比值应在 2.0 左右。

常见问题分析

1、提取到的 RNA 得率很低。

可能的原因如下:
1
、样品裂解或匀浆处理不彻底。
2
RNA 沉淀条件和时间太短,没有充分沉淀 RNA 造成 RNA 损失。
3
、**得到的 RNA 沉淀未完全溶解。

2RNA 降解

可能的原因如下:
1
、组织取出后没有马上进行处理或冷冻,导致 RNase 的释放降解样品中的RNA
2
、贴壁细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
3
、样本量太大而加入的 Trizol 液少,导致裂解不完全,不能有效** RNase的活性,进而导致 RNA 降解。
4
、提取过程中使用的溶液、离心管或*头未经 RNase 去除处理。
5
RNA 沉淀没有保存于-80°C
6
RNA 电泳时的电泳液及电泳槽中含有 RNase,或者电泳时电泳液温度过高, 造成 RNA 样品被降解。

3、蛋白和多糖污染

可能的原因如下:
1
、样品中蛋白和多糖含量高,建议加入氯仿之前先高速离心去除蛋白和多糖。
2
、吸取上层无色水相时不小心吸入一些中间蛋白层的物质,建议将移液*头中的液体放回分层的离心管中,重新进行离心后再小心吸取上层水相即可。
3
、样品量太大,裂解不完全也会导致 RNA 样品中蛋白和多糖污染。

4A260/A280 的比值低于 1.65
可能的原因如下:

1、RNA 样品溶于 TE 溶液,低离子浓度和低 pH 条件下,A280 的数值会较高, 导致比值低。
2
、样品匀浆时加的 Trizol 试剂量太少。
3
、匀浆后样品未在室温放置 5 分钟,会导致蛋白的析出不完全,也会增加 A280的数值。
4
、**得到的 RNA 沉淀溶解不完全。

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