SD大鼠支气管上皮细胞原代分离培养鉴定

A、无血清完全培养基制备：

1、Ham'sF12培养基；

2、5μg/ml牛垂体提取物；

3、3mg/ml牛血清白蛋白；

4、0.1μg/ml上皮生长因子，

5、50μmol/l磷酸乙醇胺；

6、50μg/ml胰岛素；

7、50μg/ml转铁蛋白；

8、0.3μmol/l氢化可的松（皮肤抗炎症）；

9、2mmol/l的丙酮酸钠（培液自有成分）；

B、上皮专用培液：

DMEM/F12  1:1、15%FBS、EGF 20 ng/ml、bFGF 25ng/ml、肝素钠 10ug/ml；

分离方法：

1、大鼠麻醉后，无菌条件下暴露气管和肺，截取气管组织，保留支气管；

2、环状软骨下方插管，生理盐水灌洗3次，下端在支气管末端处结扎，去除气管表面结缔组织，PBS清洗干净，然后灌入1%链酶蛋白酶，结扎气管分支处，置装有无血清培液的培养皿中保持湿润，4℃过夜（或0.25%胰酶4°消化过夜）；

3、消化时间到后，用F12培养基冲洗支气管，再剪开支气管用细胞刷充分刷洗，收集培养皿中的刷洗液，1000r/5min离心洗涤收集细胞。

4、弃上清后完全培养液重悬37°培养，24h后细胞贴壁换液；

鉴定：

免疫荧光鉴定阳性：角蛋白（CK 18）；

阴性:Vimentin;