小鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)的分离培养及鉴定
【简介】
EPCs是一群具有游走特性,能自我更新、增殖分化为内皮细胞的多能干细胞,具有迟发性高增殖潜能及定向归巢特性。它与血管新生、心血管组织工程内皮化等关系密切,在基础研究、肢体缺血性疾病及心血管疾病等领域有关EPC的研究非常活跃,从而为治疗缺血性疾病、血管组织工程及肿瘤治疗提供了新的思路和手段;
【材料】
3-8周龄小鼠、手术剪、手术镊、75%酒精、双抗PBS、Percoll淋巴细胞分离液、M199、FBS、培养皿、15ml离心管、10μg/ ml人纤连蛋白包被盖玻片;
【方法】
1)脱颈处死,75%酒精浸泡5min,将股骨、胫骨迅速从小鼠中剥离下来,置于平皿中PBS浸泡,去除表面肌肉,PBS清洗干净;
2)骨头移入新皿剪开两端,培液冲洗骨腔,吹打混匀,1000R/5min,弃上清,培液重悬;
3)悬液缓慢加入预先装有等量体积Percoll(1.083g/ml)离心管中2500R/30min(也有2300R/20min,2000R/20min);
4)收集离心后中间云雾状白膜层单个核细胞,培液洗涤两次,1000R/5-8min,弃上清;
5)含10%FBS的专用培养液重悬,37°培养,24h后将含有未贴壁细胞的上清液转入新皿培养,2-3d首换液,之后每3d换液一次(注:24h取上清重新贴壁培养和不取上清一直培养后的细胞做鉴定都是EPC细胞);
【培养】
内皮专用培养液:10%FBS、M199(50ug/ml ECGS)、b-FGF(20ng/ ml)、VEGF(10-20ng/ml)、肝素钠(10ug/ml);
【鉴定】
1)免疫荧光阳性:
造血干/祖细胞标志(CD133、CD34)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)、血管性血友病因子(vWF);
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1226天
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