EdU细胞增殖检测

EdU细胞増殖检测试剂盒(红色荧光)使用说明

 

产品简介

       细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)掺入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与荧光染料的特异性共轭反应,把荧光集团标记到新合成的含有EdUDNA上面,这样就可以进行高效快速的检测出DNA复制活性,广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复等方面的研究。
       传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法需要DNA变性、抗原修复、抗原抗体过夜孵育等复杂繁琐的操作步骤。而EdU检测方法不需要剧烈的DNA变性,只需温和的细胞固定化和透化处理,能够较好地保护细胞形态、DNA整体结构及细胞内抗原识别位点,操作步骤更加快速、灵敏和准确。EdU与胸腺嘧啶(T )结构非常相似,而EdU染料大小只有BrdU抗体的1/500,在细胞内很容易扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等),可有效避免样品损伤,而且无需抗原抗体反应,能在细胞和组织水平更快速便捷地反映DNA复制活性。

试剂盒组分


产品编号

试剂

浓度

试剂量

保存条件

 
 
 
C1501/1502/1503
 
 

EdU溶液

1000X

40ul

室温运输,4℃长期储存,勿冻存,荧光试剂请避光保存。

反应缓冲液

10X

1 ml

催化剂溶液

25x

400ul

TAMRA  色荧光溶液

400x

25ul

缓冲添加剂

粉末

200 mg

Hoechst 33342

1000X

20ul

 


使用前须知
       该产品是采用成像检测方法对贴壁细胞进行检测,适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜等仪器。非贴壁细胞可在孵育EdU后进行细胞涂片处理,固定后再采用贴壁细胞的染色流程进行检测。也可以应用于流式细胞仪检测。

实验步骤(24孔板,HK2贴壁细胞为例)

EdU标记
(a)      将细胞完全培养基中按照500: 1的 比例加入EdU溶液,制成2xEdU标记培养基;
(b)      提前将2xEdU标记培养基预热,然后等体积加入到细胞原有培养基中,获得lxEdU溶液,其中EdU的终浓度为10 uM
注:    1)我们不建议替换全部培养基,因为这样可能会影响细胞增殖的速度;
           2)配置好的培养基建议现用现配,用量以没过细胞为宜;
(c)      每孔加入300ulEdU培养基孵育细胞2小时,弃培养基;
注:   1)培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态;
          2)大多数**细胞以及粘附细胞系均可采用2小时的孵育时间
(d)     lxPBS清洗细胞两次,毎次5分钟,以除去未掺入DNAEdU残留。
注:  贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。

细胞的固定和通透
(a)     每孔加入150ul 4%多聚甲醛细胞固定液,室温培养30分钟,弃固定液;
(b )    毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸,摇床孵育5分钟,以中和过量的多聚甲醛;
(c )    弃甘氨酸溶液,每孔加入300 ul PBS 洗液,室温清洗5分钟;

(d)     每孔加入300ul 0.5% Triton X-100细胞通透液,室温通透10分钟,弃细胞通透溶液;
(e )    每孔加入300ul PBS洗液,室温清洗5分钟;

EdU染色
(a)     通过用10: 1去离子水稀释10x反应缓冲液进行配制1xEdU反应缓冲液;
(b)     按照溶解200mg缓冲添加剂溶于1ml去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解, 即为可用的缓冲添加剂的浓度,建议现用现配;
注:  缓冲添加剂为白色粉末,较难准确称量,称量范围可稍微放宽,但是不应超过±20%,且该粉末较易氧化,使用后请旋紧管盖,如试剂出现棕黄色,则需报废或更换。
(c)     按照以下的表格进行染色反应液的配制:

染色反应液组分

500ul

1 ml

2 ml

5 ml

IX反应缓冲液

430ul

860ul

1.8 ml

4.3 ml

催化剂溶液

20 ul

40 ul

80 ul

200 ul

TAMRA红色荧光溶液

1.2 ul

2.5 ul

5 ul

12.5 ul

缓冲添加剂

50 ul

100 ul

200 ul

500 ul


(d)     每孔加入100ul配置好的检测混合液,以覆盖细胞为宜,避光、室温孵育30分钟。
(e)     弃染色反应液,加入300 ul  0.5% TritonX-100细胞渗透液清洗2-3次,每次10 分钟;
(f)      弃细胞渗透液,用PBS洗两次,每次5分钟。


DNA染色

(a )    Hoechst 33342PBS 溶液1: 1000 进行稀释得到终浓度为5ug/ml的 lHoechst染色液;
(b )    每孔加入300ul 1x Hoechst染色液,室温避光孵育20-30分钟后,弃染色液;
(c )    每孔加入300ul PBS洗细胞两次,去掉洗液


图像获取及分析
       建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察;如果条件限制,请于4°C条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。若为细胞爬片或涂片, 可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于4°C条件下保存及拍照检测。

荧光染料

很大激发波长

很大发射波长

荧光颜色

TAMRA

541 nm

567 nm

橘红色荧光

Hoechst 33342

350 nm

461 nm

蓝色荧光

 


           
 案例图示

QQ浏览器截图20210226095816.png

 

 

  图注:将HK2细胞分别用DMSO以及Cisplatin进行处理之后,通过我们公司的EdU检测产品检测药品处理是否影响细胞的增殖能力。

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